北京快乐8软件【研发】浅谈细胞培养代谢副产物

2018-09-19 22:11 点击:

  乳酸和铵是细胞培养过程中不可避免的两种代谢副产物,两者的累积都是不想看到的,因为这两种代谢副产物积累会影响到细胞生长、蛋白产量和质量等。文中笔者对乳酸和铵影响细胞生长的缘由,!以及如何降低两者的细胞毒性进行了简要概述。

  CHO细胞培养前期往往有少量的乳酸积累,特别是在细胞代谢旺盛的对数生长期,一般情况下细胞都可以将这些乳酸代谢消耗掉。但有时这对于某些细胞株并不顺利,乳酸的累积对细胞是致命的。乳酸主要来源于葡萄糖的不完全氧化,。乳酸的累积会使体系pH降低,为使pH回升添加的碱液往往会增加体系的渗透压,从而影响细胞正常生长代谢。,而如果不加碱液调节pH,低pH环境对于细胞体内的酶不是个好消息,酶活的降低会限制细胞代谢,!影响细胞生长。

  为解除乳酸对细胞生长及蛋白产量的影响,!可以考虑构建对环境压力耐受性高的细胞株,也可对细胞培养策略进行优化。!用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源可以降低乳酸的累积,。如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖的使用。!而当乳酸有一定累积时,可以通过葡萄糖的浓度来改变细胞的代谢路径,改葡萄糖代谢为乳酸代谢,从而减少乳酸累积,,但低糖消耗乳酸的策略对蛋白质量的影响并不明确。对细胞进行基因改造也可以降低乳酸累积,。如删除乳酸脱氢酶(LDH)基因、扩增丙酮酸羧化酶(PYC2)基因等。其中LDH是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶,PYC2是参与将乳酸、?丙酮酸、氨基酸及甘油转化生成葡萄糖的催化酶,对两者的基因改造可在代谢通路减少乳酸累积。

  上述的方法虽然可降低乳酸累积,但操作性不强。笔者认为,铜离子(Gu2+)的添加是目前为止降低乳酸累积的最佳方法,除去Gu2+抑制乳酸累积的作用,!许多研究中都提到Gu2+对细胞的生长具有促进作用。,Luo等就研究了不同浓度的Gu2+对细胞生长、乳酸累积和蛋白产量的影响,如图1所示,培养至第五天时,细胞表现开始出现差异,,高浓度Gu2+实验组细胞密度继续增加、乳酸开始消耗;而低浓度Gu2+实验组的乳酸一直在累积,,开始显现出对细胞的抑制作用;从蛋白产量看,高浓度Gu2+实验组的蛋白浓度要高些,可知Gu2+的添加可促进细胞对乳酸的消耗及细胞生长。。值得注意的是,Gu2+的添加会影响到单抗的质量,。如增加碱性峰的比例、,降低高甘露糖型水平等。

  作为细胞培养过程中的另一代谢副产物,铵受到的关注远没有乳酸多,这是因为目前使用的CHO细胞中多采用的谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统,而GS细胞一般都可以利用铵来合成谷氨酰胺,,因此关于降低铵累积对细胞毒性作用的研究较少。然而并不是所有的细胞系都是GS系统,还有二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase,北京快乐8软件DHFR)筛选系统等,因此对铵的毒性机理、降低累积的认识还是很有必要的,?可以帮助我们更好的理解细胞培养过程。

  体系中的铵主要来自于谷氨酰胺等的代谢降解和自发降解,,其中自发降解只占很少一部分,大部分的铵都来自氨基酸如谷氨酰胺的代谢降解。正常情况下,培养体系中、细胞质内和线)是处于一种动态平衡下的,一定的pH时两者维持一定的浓度,同样两者的平衡也是维持细胞胞内pH稳定的重要条件。而当其中之一,如NH4+的浓度超出正常范围时,平衡被打破,,进而引起胞内pH的变化,影响细胞代谢相关酶的活性,?不利于细胞的正常生长与代谢。还有学者认为,由于铵本身就参与部分酶促反应,,如谷氨酸和铵合成谷氨酰胺的反应、谷氨酸的进一步降解等,铵浓度的改变也会对此类代谢产生不可预估的影响。

  由此可知,。铵的累积会导致胞内pH失衡及酶活降低,,进而影响细胞表现。此外,!铵的累积还会对蛋白质量造成影响,?主要表现在降低糖链末端的唾液酸化水平。,高浓度铵水平下,α(2,3)-唾液酸转移酶和GMP-唾液酸转运蛋白水平都有一定降低,这不仅会导致胞液中唾液酸向高尔基体的转动量降低,还会影响糖链上的唾液酸连接,,最终降低蛋白的唾液酸化。

  根据铵的来源来降低是重要的策略,如采用不易自发降解的谷氨酰胺衍生物代替谷氨酰胺,,以及使用谷氨酸代替谷氨酰胺添加到培养基中都是可以的方法。还有学者以氨基酸为出发点,研究了不同氨基酸对降低铵对细胞毒性的影响,最终得出苏氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)和甘氨酸(glycine)可以抑制高浓度铵对细胞的毒性。。如图2所示,,同样高浓度NH4Cl的情况下,添加以上三种氨基酸实验组的细胞要高些。。基因手段也可以降低铵的累积,?例如删除乳酸脱氢酶(LDH)基因,有学者进行相关实验时发现LDH基因删除的实验组,其乳酸及铵累积均有一定的降低。另外,合理的谷氨酰胺和葡萄糖补料策略也是控制铵浓度的方法之一。

  知行,。生物化工硕士,从事细胞培养方面的研究。工作之余密切关注国内外医药行业动态以及研究进展,,用简单的语言讲述不简单的未来,一个不断前行的医药人。